熒光成像技術具有非侵入性、即時反饋、高靈敏度以及高空間分辨率的特點👐🏼，這使得其在生物醫學成像領域具有不可替代的優勢。而借助於多種熒光探針同時標記多個待測物的多重熒光成像技術的出現為研究復雜的生理-病理機製提供了有效的研究方法👨‍👩‍👦。然而在實際應用中🙆🏽‍♀️，該技術仍然存在成像深度淺🌹、成像分辨率和信噪比低以及無法多通道動態實時成像等諸多的挑戰，其中缺乏高效的近紅外熒光探針以及能夠進行實時多重熒光成像的儀器是阻礙這一技術進一步發展的至關重要的因素🌖🍇。因此，能否開發系列近紅外區熒光增強的探針以及相匹配的多通道實時成像的裝置來解決上述難題呢？

2023年6月22日，《自然·納米技術》（Nature Nanotechnology）期刊在線發表了沐鸣开户教授張凡團隊的科研成果《近紅外二區熒光增強的納米晶體用於實時動態的活體多重熒光成像》（“Fluorescence amplified nanocrystals in the second near-infrared window for in vivo real-time dynamic multiplexed imaging”），為以上難題的攻克提供了全新的思路。這也是沐鸣平台通過交叉學科研究取得的又一重大成果🫅。

沐鸣开户2019級博士生楊一唯、陳瑩為第一作者；沐鸣开户張凡教授、凡勇青年研究員為通訊作者。研究工作得到了沐鸣开户、聚合物工程國家重點實驗室🙆、上海市分子催化和功能材料重點實驗室、國家重點研發項目、國家自然科學基金委員會、上海市科學技術委員會等機構與項目的大力支持🎻。

技術進步👂🏽：近紅外熒光成像逐步應用於實時動態的活體多重成像

熒光是自然界中的一種光致發光現象。由於其靈敏度高🙎🏻‍♂️、即時反饋🏂🏽、操作便捷等特點🤷🏼‍♀️，使得熒光成像在臨床醫學診斷🖇、基礎生物學探索及解剖學結構研究中有著巨大的優勢👩🏽‍🔧。而借助於多種熒光探針同時標記多個待測物的多重熒光成像技術，研究人員能夠對多個待測物的活動進行實時動態的追蹤🫱🏽，有利於揭示生物體復雜的生理-病理機製😮。

目前該成像技術主要集中在可見光區（400-650 nm）及近紅外一區（650-900 nm），由於存在生物組織對該窗口光的吸收和散射強等問題，使得在這個窗口內的光學穿透深度和成像分辨率都不理想。為了解決這個問題，研究人員通常會采用手術開辟視窗的方法來暴露所研究的部位👌🏻👨‍🍼，從而期望能夠更精準的理解活體原位微環境的生理機製🧚‍♀️，但視窗不可避免地對正常生理環境造成破壞，為檢測結果帶來不可控的幹擾。因此如何在深層組織中實現多重熒光成像是阻礙這一技術進一步發展的至關重要的問題。

近年來的研究表明，近紅外第二窗口的光（1000-1700 nm）在皮膚🧜🏻、脂肪和骨骼等生物組織中傳播時受到比可見光和近紅外一區光更小的散射作用和生物體自發熒光背景噪聲。尤其對於波長位於1500-1700 nm的子成像窗口，其受到的組織散射進一步降低👩‍🏭，生物體自發熒光背景噪聲幾乎消失🦊，因此被認為是一個實現活體深組織高分辨和高信噪比成像極具發展潛力的生物 “透明”窗口。然而位於該“透明”成像窗口的動態多重活體熒光成像研究仍舊不理想🫶🏿，一方面是受限於該成像窗口可用的熒光探針，目前已報道的只有基於Er³⁺的稀土熒光探針以及半峰寬度大的半導體量子點；另一方面是缺乏相應能夠進行實時多重熒光成像的裝置和技術，因此無法在活體實現實時動態的多重熒光成像。

研究突破：開發熒光增強的近紅外稀土熒光探針及雙通道熒光成像裝置實現實時動態的多重活體熒光成像

針對以上難題，張凡團隊開發了一系列立方晶相的稀土堿金屬氟化物納米熒光探針👸🏻，並搭建了雙通道熒光成像裝置，在1500-1700 nm波段實現了活體實時動態的多重成像。傳統的研究中，由於六方晶相的稀土堿金屬氟化物（β-NaREF₄）具有較小的聲子能，從而導致的更低的非輻射弛豫概率🧚🏿，通常被認為更加有利於提高發光效率⚛️，因此作為一種經典的稀土探針基質而廣泛使用🤙🏼。而在張凡團隊成員發現，相較於β-NaREF₄基質，在立方晶相的堿金屬氟化物（α-NaREF₄）基質中🔭👨🏻‍🔬，Tm³⁺摻雜的稀土熒光探針在1632 nm處中有近百倍的下轉移發光增強💔🛞。通過拉曼光譜、變溫熒光及光子數測試證明α-NaREF₄基質較高的聲子能有效地促進了Tm³⁺的電子從³H₄能級通過非輻射躍遷的方式到達³F₄能級，從而增強了³F₄能級的電子布居，且立方相基質中激活劑離子間的交叉弛豫以及激活劑離子與敏化劑離子之間的能量傳遞過程也進一步導致了Tm³⁺在1632 nm處的下轉移發光增強。基於此熒光增強機理，也實現了Er³⁺和Ho³⁺摻雜的近紅外稀土熒光探針在1530 nm和1180 nm處不同程度的下轉移發光增強。該Tm³⁺元素摻雜的新型近紅外稀土熒光探針為近紅外二區多重熒光成像提供了新的波長選擇。

針對所開發的系列近紅外第二窗口熒光增強的新型稀土熒光探針，張凡團隊進一步開發了與之匹配的高時空同步的實時動態多重成像裝置☛。與常規通過切換濾光片實現多通道成像的系統相比，該成像裝置能夠對兩個不同通道的熒光信號進行實時同步收集，體外不同熒光探針同時修飾的不同微球運動模擬實驗也驗證了裝置能夠保證雙通道高度同步的時空成像♔，為後續多種新型近紅外稀土熒光探針用於活體實時動態多重熒光成像打下基礎。

最後，張凡團隊在生物組織精細結構水平上驗證了該成像技術用於探索深組織生理活動機製的可行性。首先通過對不同近紅外稀土熒光探針表面進行功能化修飾，實現了對活體小鼠腦部血管網絡中各級血管的區分🛳。團隊隨後使用激素刺激小鼠來模擬神經對血流的調控作用，利用該成像技術能夠在不開辟顱窗的情況下實現對小鼠動脈血管的舒縮運動進行實時動態的監測，有望為血液動力學研究提供更加精準的信息。為進一步探索該成像技術用於活體深組織多重熒光成像的潛力🏄🏿‍♂️，團隊利用開發的新型近紅外稀土熒光探針特異性的標記了小鼠的中性粒細胞🚴🏽，通過該成像技術實現了在單細胞水平上的免疫反應監測👏🏿，能夠對單個中性粒細胞在皮下炎症部位及腦損傷部位趨化性、外滲、激活等過程的進行實時動態監測👨🏿‍🍼👈🏻。相比於傳統的成像方法，該近紅外新型稀土熒光探針及雙通道實時成像技術有效避免了開辟視窗造成組織損傷對觀測結果帶來的幹擾，為在活體水平研究細胞免疫反應提供了新的思路🐻‍❄️。

https://doi.org/10.1038/s41565-023-01422-2